PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز، یک تکنیک آزمایشگاهی پیچیده است که به طور گسترده در پزشکی و سایر زمینه های علمی استفاده می شود. تشخیص PCR در یک زمان به یک پیشرفت واقعی در علم تبدیل شد.
شرح
PCR کمی نوعی PCR بلادرنگ است.
این به عنوان گونه‌ای از PCR شناخته می‌شود که در آن سینتیک واکنش به طور مداوم ثبت می‌شود، که ارزیابی کیفی محتوای توالی‌های نوکلئوتیدی DNA خاص در یک مخلوط مولکولی پیچیده را ممکن می‌سازد.
روش کمی PCR با جزئیات بیشتر در زیر مورد بحث قرار خواهد گرفت.
ماهیت تحلیل
روش های فرهنگی و سرولوژیکی به ویژه اغلب برای تشخیص عفونت استفاده می شود. تحت اول، آنتی بادی های یک پاتوژن عفونی در سرم خون تعیین می شود. در مرحله دوم، از مواد بیولوژیکی گرفته شده از یک فرد بیمار برای کاشت محیط خاصی استفاده می شود که برای رشد کلنی های پاتوژن مطلوب است. تشخیص در هر دومورد ممکن است روزها یا هفته ها طول بکشد.
معاینه PCR را می توان با مواد بیولوژیکی مختلفی که از یک فرد بیمار تهیه می شود انجام داد. خون و سایر رسانه ها و مایعات پاتولوژیک، فیزیولوژیکی و بیولوژیکی به عنوان نمونه عمل می کنند. می توانید مدفوع یا ادرار PCR انجام دهید.
عفونت‌های غیر معمول و ویروسی اغلب با روش کمی PCR تشخیص داده می‌شوند، زیرا به دلیل ماهیت خاص فرآیند پاتولوژیک ناشی از آنها، تشخیص آنها ممکن است آسان نباشد. برای تعیین چنین عفونت هایی، زمان لازم است، در طی آن آنتی بادی ها شروع به تولید در بدن می کنند که با روش های سرولوژیکی تعیین می شود. اما این در برخی موارد غیرقابل قبول است.
روش انجام
روش PCR - تشخیص آزمایشگاهی عفونت در نمونه های جدا شده از بیمار (In vitro).
برای انجام یک واکنش زنجیره ای پلیمراز، مجموعه ای از معرف های ویژه مورد نیاز است.
مواد آزمایش با معرف وارد لوله های آزمایش می شود. لوله های آزمایش در یک دستگاه ویژه قرار می گیرند - تقویت کننده PCR، که برای تقویت (افزایش تعداد) قطعات RNA یا DNA مورد نظر طراحی شده است، تقویت کننده PCR در حالت چرخه ای عمل می کند. در هر چرخه ای، اگر نمونه ها حاوی توالی RNA یا DNA پاتوژن باشند، کپی های بیشتری از ذرات این اسیدهای نوکلئیک در محلول جمع می شوند. شما می توانید وجود پاتوژن و مقدار آن را در نمونه ها تعیین کنید.
انواع PCR
تجزیه و تحلیل کیفی توسط PCR به شما امکان می دهد نتیجه زیر را دریافت کنید:
- منفی وقتی پاتوژن مورد نظر در نمونه ها یافت نشد؛
- مثبت اگر توالی‌هایی در نمونه‌ها یافت شود که مشخصه یک پاتوژن خاص است.
با نتیجه مثبت PCR، می توانیم با دقت 95 درصد در مورد وجود عفونت تشخیص داده شده صحبت کنیم. در عین حال، دقت مجموعه‌های PCR مورد استفاده برای اهداف تشخیصی به 100% می‌رسد.
معمولاً 5% از نتایج نادرست توسط عامل انسانی تعیین می شود. به عنوان مثال، نقض تکنیک تجزیه و تحلیل و ذخیره معرف ها می تواند به طور قابل توجهی دقت مطالعه را کاهش دهد.
PCR کمی مفهوم بار ویروسی را تعریف می کند. می توان تعیین کرد که چند مجموعه از DNA پاتوژن در نمونه های گرفته شده از بیمار وجود دارد.
شدت عفونت با افزایش تعداد آنها نسبت مستقیم دارد. همچنین می‌توانید موفقیت درمان را برای کاهش بار ویروسی تعیین کنید.
ارسال برای بیومتریال PCR
PCR کمی در کلینیک عمدتاً در صبح انجام می شود. در طی ملاقات با پزشک، به بیمار گفته می شود که چه چیزی باید مصرف شود: خراشیدن، اسمیر، ادرار یا خون. PCR می تواند عوامل بیماری زا را بدون توجه به سطح آلودگی مواد شناسایی کند.
برای تجزیه و تحلیل مثبت، از نظر تئوری، وجود تنها یک پاتوژن در نمونه ها مورد نیاز است. آنها در عمل سعی می کنند شرایط مطلوب تری را ایجاد کنند. چند توصیه برای این وجود دارد:
- اگر از اندام تناسلی خراش یا سواب بگیرنداعضای بدن، باید سه روز قبل از مطالعه از رابطه نزدیک خودداری کنید؛
- شما نمی توانید قبل از تجزیه و تحلیل با داروهای ضد باکتری دوش بگیرید یا خود را بشویید؛
- سه ساعت قبل از گرفتن اسمیر از مجرای ادرار، باید صبور باشید و روده خود را خالی نکنید.
هنگام اهدای خون از این قوانین پیروی نکنید.
نتایج تجزیه و تحلیل کمی PCR چگونه تفسیر می شود؟
ارزیابی کمی نتایج به دست آمده
در تعدادی از موقعیت های بالینی، مشکل اثربخشی درمان و / یا پویایی فرآیند آسیب شناسی ظاهر می شود. چنین سؤالاتی به ویژه هنگام معاینه افراد مبتلا به عفونت های مزمن (ویروس نقص ایمنی انسانی، هپاتیت B و C) مرتبط هستند. هنگام تشخیص، آنها بر اساس این واقعیت هستند که تجمع آمپلیکون ها (محصولات PCR) با وجود نسخه هایی از ژن مورد نظر در نمونه آنالیز شده متناسب است.
البته با در نظر گرفتن نتایج PCR کمی به روش ژل الکتروفورز با بررسی شدت سیگنال های خاص PCR انجام می شود. همچنین، پیش نیاز ارزیابی کمی صحیح نتایج به دست آمده، نمونه های کنترل قابل اعتماد مثبت حاوی تعداد مشخصی از نسخه های ژن مورد نظر است (مثلاً هزار نسخه از ژن هپاتیت C برای یک واکنش PCR). چندین رقت سریال کنترل کمی اجازه می دهد تا منحنی های کالیبراسیون ایجاد شود و برای ارزیابی محتوای ژنوکپی های بالینی در نمونه های بالینی استفاده شود.
در تعریف PCR کمی، یک دستاورد کلیدی ایجادپروب های DNA فلورسنت که به طور همزمان با پرایمرهای ساده به مخلوط واکنش اضافه می شوند و به شما امکان می دهند فرآیند PCR را به موقع دنبال کنید، یعنی PCR در زمان واقعی.
روش TaqMan به سنتز پروب های DNA فلورسنت اشاره دارد که مخصوص قسمت میانی آمپلیکون هستند و دارای دو برچسب در انتها هستند. یکی از آنها یک برچسب فلورسنت است، دومی یک مولکول خاموش کننده برای این فلورسانس است.
یک دستگاه خاص که ترکیبی از فلورمتر و تقویت کننده ترموبلاک است، اندازه گیری ثابت فلورسانس را در هر لوله آزمایش انجام می دهد (اصل Real-time PCR). پس از 20-40 سیکل PCR، منحنی های جداگانه برای هر نمونه به دست می آید. تعداد کپی های ژن مورد نظر که در نمونه آزمایشی موجود است را می توان از روی منحنی های کالیبراسیون با نمونه های کنترل محاسبه کرد.
همچنین یکی از ویژگی های مهم اجرای PCR به روش فلورسنت این است که با در نظر گرفتن نتایج، نیازی به باز کردن لوله ها با مخلوط PCR نیست. این امر احتمال آلودگی اتاق را با محصولات تقویت کننده کاهش می دهد و نیازی به اختصاص مناطق کاری ویژه برای الکتروفورز نیست.
رونوشت PCR کمی چه چیزی را نشان می دهد؟
چه چیزی در حال کشف است؟
از طریق روشی مانند PCR کمی، تغییرات کیفی در ژن ها یافت می شود: درج، حذف و جهش نقطه ای. اما در برخی از اختلالات ارثی، علائم مربوطه در پاسخ به تغییر در محتوای ژن‌های خاص ظاهر می‌شود.
متشکرمتجزیه و تحلیل کمی یک نتیجه عددی، اغلب در IU / ml می دهد. این بدان معناست که در یک میلی لیتر از نمونه آزمایش، تعداد معینی کپی از RNA یا DNA پاتوژن که در واحدهای بین المللی اندازه گیری شده است، یافت شد.
بسته به بزرگی، شدت عفونت تشخیص داده می شود. معمولاً خون برای تعیین بار ویروسی آزمایش می‌شود، زیرا ویروس‌ها در طول بیماری آزادانه در خون حرکت می‌کنند.
ویژگی ها
PCR کمی در آزمایش خون دو ویژگی دارد.
- آنالیز در حضور پرایمرها یا تری فسفات های دئوکسی ریبونوکلئوزید انجام می شود که با برچسب فلورسنت یا رادیواکتیو برای تعیین دقیق محتوای محصول PCR تشکیل شده برچسب گذاری شده اند.
- در فرآیند PCR، قبل از ظاهر شدن تعداد زیادی از محصولات PCR، واکنش را زودتر خاتمه دهید. این به این دلیل است که در مرحله نهایی اشباع، زمانی که محصولات PCR زیادی وجود دارد، هم خود آنزیم و هم سوبستراها به عنوان حلقه های محدود کننده این واکنش عمل می کنند. پایان چرخه بعدی PCR در چنین شرایطی دیگر با دو برابر شدن تعداد محصولات PCR مشخص نمی شود، تفاوت های کمی ناچیز بین نمونه های مختلف مشخص می شود که در مراحل اولیه پس از عبور از یک سری چرخه واکنش کاملاً واضح است..
هزینه تشخیص PCR
تحقیق PCR هزینه ای دارد که بستگی به نوع عفونت آزمایش شده، روش آنالیز و مواد آزمایش دارد. برای تعیین یک عفونت، شما باید در داخل بدهید200-800 روبل. هزینه مصرف بیومتریال نیز اضافه می شود - تقریباً 400 روبل.
