فلوسیتومتری یک روش تحقیقات سیتولوژیکی است که برای تجزیه و تحلیل عمیق سلول ها استفاده می شود. مزیت آن این است که به شما امکان می دهد هر سلول را به صورت جداگانه مطالعه کنید. این نوع تجزیه و تحلیل به ارزیابی چندین پارامتر در صدها سلول در عرض چند ثانیه کمک می کند. در نتیجه، سیتوفلوریمتری یکی از سریع‌ترین و دقیق‌ترین روش‌های آنالیز است که در حال حاضر در دسترس دانشمندان و پزشکان است.
اصل
اصل فلوسیتومتری بر اساس اندازه گیری پراکندگی نور و لومینسانس (فلورسانس) سلول ها است. سوسپانسیون سلولی به صورت جریانی با سرعت بالا از سلول سیتومتر عبور داده می شود و در آنجا با لیزر تابش می شود. به اصطلاح تمرکز هیدرودینامیکی نیز در آنجا انجام می شود. مکانیسم آن به این صورت است که جریان از سلول با ذرات مورد مطالعه در خروجی به جت خارجی جریان می یابد که سرعت بیشتری دارد. در نتیجه، ذرات در یک زنجیره مرتب قرار می گیرند.
پیش سلول ها با رنگ های فلورسنت ویژه (فلوروکروم) برچسب گذاری می شوند. با تشکر از آنها، پرتو لیزردرخشش ثانویه را تحریک می کند. سیگنال های نوری دریافتی توسط آشکارسازها ثبت می شوند. متعاقباً، اطلاعات با استفاده از الگوریتم‌های نرم‌افزاری پردازش می‌شوند که به شما امکان می‌دهد تعداد سلول‌های فردی را که در برخی معیارها متفاوت هستند، بشمارید.
تحقیق با میکروسکوپ معمولی اغلب نمی تواند بین سلول های مختلف تمایز قائل شود زیرا آنها یکسان به نظر می رسند. سیتوفلوریمتری می‌تواند داده‌های دیگری (یکپارچگی ساختار DNA)، بیان پروتئین، بقای سلول را تجزیه و تحلیل کند.
از آنجایی که تحریک فلوروکروم ها به پرتوهای نور با طول موج های مختلف و همچنین انواع آشکارسازها نیاز دارد، تاسیسات مدرن به چندین کانال تشخیص (از 4 تا 30) مجهز شده اند. تعداد ساطع کننده های لیزر می تواند از 1 تا 7 باشد. دستگاه های پیچیده تر امکان مطالعات چند پارامتری چندین ویژگی ذرات را به طور همزمان فراهم می کنند.
مزایا و معایب
مزایای فلوسیتومتری عبارتند از:
- سرعت پردازش بالا (ثبت 30 هزار رویداد در 1 ثانیه)؛
- امکان مطالعه تعداد زیادی سلول (تا 100 میلیون در یک نمونه)؛
- تعیین کمی شدت نور فلورسنت؛
- آنالیز هر سلول؛
- مطالعه همزمان فرآیندهای ناهمگن؛
- جداسازی خودکار داده ها بر اساس جمعیت سلولی؛
- تجسم با کیفیت نتایج.
یکی دیگر از ویژگی های این فناوری این است کهذرات تجزیه و تحلیل شده را می توان با چندین محلول فلورسنت رنگ آمیزی کرد. به لطف این، یک مطالعه چند پارامتری رخ می دهد.
معایب شامل پیچیدگی تجهیزات فنی و نیاز به آماده سازی نمونه خاص است.
سیتومتر
اولین دستگاه هایی از این نوع قبلاً در سال 1968 در آلمان ظاهر شدند، اما بسیار بعداً گسترده شدند. در حال حاضر تمام دستگاه هایی که با روش فلوسیتومتری کار می کنند به 2 نوع تقسیم می شوند:
- دستگاه‌هایی که تشعشعات فلورسنت (دو یا بیشتر از طول موج)، پراکندگی نور 10 درجه و 90 درجه (آشکارساز پراکندگی جانبی و زاویه کم) را اندازه‌گیری می‌کنند؛
- دستگاه‌هایی که علاوه بر اندازه‌گیری چندین پارامتر سلولی، به‌طور خودکار طبق این معیارها به گروه‌هایی دسته‌بندی می‌شوند.
آشکارساز پراکندگی رو به جلو برای تعیین اندازه سلول طراحی شده است و دستگاه پراکنده جانبی به شما امکان می دهد اطلاعاتی در مورد وجود گرانول های داخل سلولی، نسبت حجمی سیتوپلاسم و هسته به دست آورید..
سیتومترهای کلاسیک، بر خلاف میکروسکوپ های نوری، اجازه نمی دهند تصویری از یک سلول به دست آید. با این حال، در سال های اخیر، دستگاه های ترکیبی ساخته شده اند که قادر به ترکیب قابلیت های میکروسکوپ و سیتوفلوریمتر هستند. آنها در زیر مورد بحث قرار خواهند گرفت.
سیتومترهای تصویربرداری
برای ابزارهای مورد استفاده در فلوسیتومتری کلاسیک،یک ویژگی مشخصه است: اگر رویدادهای نادر در جمعیت سلول های تجزیه و تحلیل شده ثبت شود، هیچ راهی برای ارزیابی ماهیت آنها وجود ندارد. این ذرات می توانند یا بقایای سلول های مرده باشند یا گروهی نادر از آنها. در دستگاه‌های معمولی، چنین داده‌هایی از جریان عمومی رویدادها حذف می‌شوند، اما این داده‌ها هستند که می‌توانند برای تجزیه و تحلیل علمی و بالینی ارزش خاصی داشته باشند.
نسل جدید فلوسیتومترهای تصویربرداری به شما امکان می دهد از هر سلولی که در جریان از ناحیه آشکارساز عبور می کند تصویری بگیرید. با کلیک بر روی ناحیه مربوطه نمودار که در مانیتور کامپیوتر نمایش داده می شود، به راحتی می توان آن را مشاهده کرد.
حوزه های کاربردی
فلوسیتومتری یک روش جهانی است که در بسیاری از زمینه های پزشکی و علم استفاده می شود:
- ایمونولوژی;
- انکولوژی؛
- پیوند شناسی (پیوند مغز استخوان قرمز، سلول های بنیادی)؛
- هماتولوژی;
- سم شناسی;
- بیوشیمی (اندازه گیری اسیدیته داخل سلول، مطالعه سایر پارامترها)؛
- داروشناسی (ایجاد داروهای جدید)؛
- میکروبیولوژی؛
- انگل شناسی و ویروس شناسی؛
- اقیانوس شناسی (مطالعه فیتوپلانکتون برای ارزیابی وضعیت آب و سایر وظایف)؛
- تکنولوژی نانو و تجزیه و تحلیل میکروذرات.
ایمونولوژی
سیستم ایمنی انسان از طیف گسترده ای از سلول ها تشکیل شده است. فلوسیتومتری در ایمونولوژی ارزیابی ساختار و عملکرد آنها را امکان پذیر می کند، یعنی انجام مورفوفانکشنال.تجزیه و تحلیل.
چنین تحقیقاتی به درک ماهیت پیچیده ایمنی کمک می کند. فنوتیپ های سلولی در نتیجه فعال شدن توسط آنتی ژن ها، ایجاد آسیب شناسی ها و سایر عوامل تغییر می کنند. سیتوفلورومتری می‌تواند زیرجمعیت‌های سلول‌های ایمنی را در یک مخلوط پیچیده جدا کند و تمام تغییرات آنها را در طول زمان ارزیابی کند.
انکولوژی
یکی از مهمترین وظایف در انکولوژی تمایز سلولها بر اساس نوع آنهاست. اصل آنالیز توسط فلوسیتومتری در انکوهماتولوژی بر اساس پدیده زیر است: هنگامی که یک نمونه با یک رنگ فلورسنت خاص درمان می شود، به پروتئین های سیتوپلاسمی متصل می شود. پس از تقسیم در سلول های در حال تکثیر فعال، محتوای آن به نصف کاهش می یابد. بر این اساس، شدت لومینسانس سلولی دو برابر کاهش می یابد.
راه های دیگری برای تشخیص سلول های در حال تکثیر وجود دارد:
- استفاده از رنگهای متصل شونده به DNA (پروپیدیوم یدید)؛
- استفاده از اوراسیل نشاندار؛
- ثبت افزایش سطح بیان پروتئین های سیکلین که در تنظیم چرخه سلولی نقش دارند.
