برای تعیین ترکیب کیفی بسیاری از محصولات غذایی، از واکنش زانتوپروتئین برای پروتئین استفاده می شود. وجود آمینو اسیدهای معطر در ترکیب باعث تغییر رنگ مثبت نمونه آزمایش می شود.
پروتئین چیست
به آن پروتئین نیز می گویند که ماده ساختمانی برای یک موجود زنده است. پروتئین ها حجم ماهیچه ها را حفظ می کنند، ساختارهای بافت آسیب دیده و مرده اندام های مختلف، اعم از مو، پوست یا رباط ها را بازیابی می کنند. با مشارکت آنها گلبول های قرمز خون تولید می شود، عملکرد طبیعی بسیاری از هورمون ها و سلول های سیستم ایمنی تنظیم می شود.
این یک مولکول پیچیده است که یک پلی پپتید با جرم بیشتر از 6103 دالتون است. ساختار پروتئین توسط بقایای اسید آمینه در مقادیر زیاد تشکیل شده است که توسط یک پیوند پپتیدی به هم متصل شده اند.
ساختار پروتئین
یک ویژگی متمایز این مواد در مقایسه با پپتیدهای با وزن مولکولی کم، ساختار سه بعدی فضایی توسعه یافته آنها است که توسط تأثیرات مختلف پشتیبانی می شود.درجه جذابیت پروتئین ها ساختار چهار سطحی دارند. هر کدام از آنها ویژگی های خاص خود را دارند.
سازمان اولیه مولکول های آنها بر اساس توالی اسید آمینه است که ساختار آن توسط واکنش زانتوپروتئین به پروتئین شناخته می شود. چنین ساختاری یک پیوند پپتیدی -HN-CH-CO- است که به طور دوره ای تکرار می شود و رادیکال های زنجیره جانبی در اسیدهای آمینه کربوکسیلیک بخش انتخابی هستند. این آنها هستند که خواص ماده را به عنوان یک کل در آینده تعیین می کنند.
ساختار پروتئین اولیه به اندازه کافی قوی در نظر گرفته می شود، این به دلیل وجود برهمکنش های کووالانسی قوی در پیوندهای پپتیدی است. شکل گیری سطوح بعدی بسته به علائم ایجاد شده در مرحله اولیه رخ می دهد.
تشکیل یک ساختار ثانویه به دلیل پیچاندن توالی اسید آمینه به یک مارپیچ امکان پذیر است که در آن پیوندهای هیدروژنی بین پیچ ها برقرار می شود.
سطح سوم سازماندهی یک مولکول زمانی تشکیل می شود که بخشی از مارپیچ بر روی قطعات دیگر قرار می گیرد و با ظهور انواع پیوندها بین آنها، با یک ترکیب هیدروژن، دی سولفید، کووالانسی یا یونی، قرار می گیرد. نتیجه تداعی هایی به شکل کروی است.
آرایش فضایی ساختارهای سوم با تشکیل پیوندهای شیمیایی بین آنها منجر به تشکیل فرم نهایی مولکول یا سطح چهارتایی می شود.
اسیدهای آمینه
خواص شیمیایی پروتئین ها را تعیین می کنند. حدود 20 اسید آمینه اصلی وجود دارد،در ترکیب پلی پپتیدها در توالی های مختلف گنجانده شده است. این همچنین شامل اسیدهای آمینه کربوکسیلیک کمیاب به شکل هیدروکسی پرولین و هیدروکسی لیزین است که مشتقات پپتیدهای اساسی هستند.
به عنوان نشانه ای از واکنش گزانتوپروتئین در تشخیص پروتئین، وجود اسیدهای آمینه مجزا باعث تغییر رنگ معرف ها می شود که نشان دهنده وجود ساختارهای خاص در ترکیب آنها است.
همانطور که مشخص شد، همه آنها اسیدهای کربوکسیلیک هستند که در آن اتم هیدروژن با یک گروه آمینه جایگزین شده است.
یک مثال از ساختار یک مولکول، فرمول ساختاری گلیسین (HNH− HCH−COOH) به عنوان ساده‌ترین اسید آمینه است.
در این مورد، یکی از هیدروژن های CH2- کربن را می توان با یک رادیکال طولانی تر، از جمله حلقه بنزن، آمینو، سولفو، گروه های کربوکسی جایگزین کرد..
واکنش زانتوپروتئین به چه معناست
روش های مختلفی برای آنالیز کیفی پروتئین استفاده می شود. اینها شامل واکنش‌ها می‌شوند:
- بیورت با رنگ بنفش؛
- نین هیدرین برای تشکیل محلول آبی-بنفش؛
- فرمالدئید با رنگ‌آمیزی قرمز؛
- فویل با رسوب خاکستری-سیاه.
هنگام انجام هر روش، وجود پروتئین ها و وجود یک گروه عاملی خاص در مولکول آنها ثابت می شود.
واکنش زانتوپروتئین به پروتئین وجود دارد. به آن تست مولدر نیز می گویند. به واکنش های رنگی روی پروتئین ها اشاره دارد، درکه اسیدهای آمینه آروماتیک و هتروسیکلیک هستند.
یکی از ویژگی های چنین آزمایشی فرآیند نیتراسیون بقایای اسید آمینه حلقوی با اسید نیتریک، به ویژه، افزودن یک گروه نیترو به حلقه بنزن است.
نتیجه این فرآیند تشکیل یک ترکیب نیترو است که رسوب می کند. این علامت اصلی واکنش زانتوپروتئین است.
چه اسیدهای آمینه تعیین می شود
همه اسیدهای آمینه کربوکسیلیک را نمی توان با استفاده از این آزمایش تشخیص داد. ویژگی اصلی واکنش گزانتوپروتئین در تشخیص پروتئین، وجود حلقه بنزن یا هتروسیکل در مولکول اسید آمینه است.
از اسیدهای آمینه کربوکسیلیک پروتئین، دو اسید معطر جدا می شود که در آنها یک گروه فنیل (در فنیل آلانین) و یک رادیکال هیدروکسی فنیل (در تیروزین) وجود دارد.
واکنش گزانتوپروتئین برای تعیین اسید آمینه هتروسیکلیک تریپتوفان که دارای هسته ایندول معطر است استفاده می شود. وجود ترکیبات فوق در پروتئین باعث تغییر رنگ مشخص محیط آزمایش می شود.
چه معرفهایی استفاده می شود
برای انجام واکنش زانتوپروتئین، باید محلول 1% تخم مرغ یا پروتئین گیاهی تهیه کنید.
معمولاً از تخم مرغ استفاده کنید که برای جدا کردن بیشتر پروتئین از زرده شکسته می شود. برای به دست آوردن محلول، پروتئین 1% در ده برابر مقدار آب تصفیه شده رقیق می شود. پس از حل شدن پروتئین، مایع حاصل باید از طریق چندین لایه گاز فیلتر شود.این محلول باید در جای خنک نگهداری شود.
می توانید واکنش را با پروتئین گیاهی انجام دهید. برای تهیه محلول از آرد گندم به مقدار 0.04 کیلوگرم استفاده می شود. 0.16 لیتر آب تصفیه شده اضافه کنید. مواد در یک فلاسک مخلوط می شوند که به مدت 24 ساعت در جای سرد با دمای حدود 1+ درجه سانتیگراد قرار می گیرد. پس از یک روز، محلول تکان داده می شود، پس از آن ابتدا با پشم پنبه و سپس با یک فیلتر کاغذی صاف می شود. مایع حاصل در جای سرد نگهداری می شود. در چنین محلولی، عمدتاً بخش آلبومین وجود دارد.
برای انجام واکنش زانتوپروتئین، از اسید نیتریک غلیظ به عنوان معرف اصلی استفاده می شود. معرف های اضافی عبارتند از: محلول 10% هیدروکسید سدیم یا آمونیاک، محلول ژلاتین و فنل غیر غلیظ.
روش شناسی
در یک لوله آزمایش تمیز محلول ۱٪ پروتئین تخم مرغ یا آرد را به مقدار ۲ میلی لیتر اضافه کنید. حدود 9 قطره اسید نیتریک غلیظ به آن اضافه می شود تا از ریزش پوسته ها جلوگیری شود. مخلوط حاصل حرارت داده می شود و در نتیجه رسوب زرد شده و به تدریج از بین می رود و رنگ آن به محلول تبدیل می شود.
هنگامی که مایع خنک می شود، حدود 9 قطره هیدروکسید سدیم غلیظ به لوله آزمایش در امتداد دیواره اضافه می شود که برای فرآیند اضافی است. واکنش محیط قلیایی می شود. محتویات داخل لوله نارنجی می شود.
ویژگی ها
از آنجایی که زانتوپروتئین واکنش کیفی به پروتئین های تحتبا عمل اسید نیتریک، آزمایش در زیر هود بخار انجام می شود. هنگام کار با مواد سوزاننده غلیظ، تمام اقدامات ایمنی را رعایت کنید.
در طول فرآیند گرمایش، محتویات لوله ممکن است خارج شود، که باید هنگام ثابت کردن آن در نگهدارنده و انتخاب شیب مورد توجه قرار گیرد.
مصرف اسید نیتریک غلیظ و هیدروکسید سدیم فقط با پیپت شیشه ای و حباب لاستیکی انجام شود، تایپ دهانی ممنوع است.
واکنش مقایسه ای با فنل
برای نشان دادن فرآیند و تأیید حضور گروه فنیل، آزمایش مشابهی با هیدروکسی بنزن انجام می شود.
2 میلی لیتر فنل رقیق شده را در یک لوله آزمایش وارد کنید، سپس به تدریج، در امتداد دیواره، 2 میلی لیتر اسید نیتریک غلیظ اضافه کنید. محلول در معرض حرارت قرار می گیرد و در نتیجه زرد می شود. این واکنش برای حضور یک حلقه بنزن کیفی است.
فرایند نیتراسیون هیدروکسی بنزن با اسید نیتریک با تشکیل مخلوطی از پارانیتروفنول و ارتونی تروفنول به نسبت 15 به 35 همراه است.
مقایسه ژلاتین
برای اثبات اینکه واکنش زانتوپروتئین به پروتئین فقط اسیدهای آمینه با ساختار معطر را تشخیص می دهد، از پروتئین هایی استفاده می شود که گروه فنلی ندارند.
محلول ژلاتین 1% را به مقدار 2 میلی لیتر در یک لوله آزمایش تمیز وارد کنید. حدود 9 قطره اسید نیتریک غلیظ به آن اضافه می شود. مخلوط حاصل گرم می شود. محلول زرد نمی شود که عدم وجود را ثابت می کنداسیدهای آمینه با ساختار معطر. گاهی اوقات به دلیل وجود ناخالصی های پروتئینی، زردی خفیف محیط مشاهده می شود.
معادلات شیمیایی
واکنش زانتوپروتئین به پروتئین ها در دو مرحله انجام می شود. فرمول مرحله اول فرآیند نیتراسیون یک مولکول اسید آمینه را با استفاده از اسید نیتریک غلیظ توصیف می کند.
یک مثال افزودن یک گروه نیترو به تیروزین برای تشکیل نیتروتیروزین و دینیتروتیروزین است. در حالت اول، یک رادیکال NO2 به حلقه بنزن متصل می شود و در حالت دوم دو اتم هیدروژن با NO2 جایگزین می شوند.. فرمول شیمیایی واکنش زانتوپروتئین با برهمکنش تیروزین با اسید نیتریک برای تشکیل یک مولکول نیتروتیروزین نشان داده می شود.
فرایند نیتراسیون با تبدیل رنگ بی رنگ به رنگ زرد همراه است. هنگام انجام واکنش مشابه با پروتئین های حاوی بقایای اسید آمینه تریپتوفان یا فنیل آلانین، رنگ محلول نیز تغییر می کند.
در مرحله دوم، محصولات نیتراسیون مولکول تیروزین، به ویژه نیتروتیروزین، با آمونیوم یا هیدروکسید سدیم برهم کنش می کنند. نتیجه نمک سدیم یا آمونیوم است که به رنگ زرد-نارنجی است. این واکنش با توانایی مولکول نیتروتیروزین برای عبور به فرم کینوئید مرتبط است. بعداً نمکی از اسید نیترونیک از آن تشکیل می شود که دارای یک سیستم کوینونی از پیوندهای مزدوج دوگانه است.
واکنش زانتوپروتئین به پروتئین ها به این ترتیب پایان می یابد. معادله دومرحله در بالا ارائه شده است.
نتایج
در طول تجزیه و تحلیل مایعات موجود در سه لوله آزمایش، فنل رقیق به عنوان محلول مرجع عمل می کند. مواد دارای حلقه بنزن واکنش کیفی با اسید نیتریک ایجاد می کنند. در نتیجه، رنگ محلول تغییر می کند.
همانطور که می دانید، ژلاتین شامل کلاژن به شکل هیدرولیز شده است. این پروتئین حاوی اسیدهای آمینه کربوکسیلیک معطر نیست. هنگام تعامل با اسید، هیچ تغییری در رنگ محیط ایجاد نمی شود.
در سومین لوله آزمایش، واکنش مثبت زانتوپروتئین به پروتئین ها مشاهده می شود. نتیجه را می توان به صورت زیر گرفت: همه پروتئین های دارای ساختار معطر، خواه یک گروه فنیل یا یک حلقه ایندول باشند، تغییر رنگی به محلول می دهند. این به دلیل تشکیل ترکیبات نیترو زرد است.
انجام یک واکنش رنگی وجود انواع ساختارهای شیمیایی در اسیدهای آمینه و پروتئین ها را ثابت می کند. مثال ژلاتین نشان می دهد که حاوی اسیدهای آمینه کربوکسیلیک است که گروه فنیل یا ساختار حلقوی ندارند.
واکنش زانتوپروتئین می تواند زرد شدن پوست را هنگامی که اسید نیتریک قوی روی آن اعمال می شود توضیح دهد. وقتی چنین تجزیه و تحلیلی با آن انجام شود، فوم شیر همان رنگ را به دست می‌آورد.
در عمل آزمایشگاهی پزشکی، از این نمونه رنگی برای تشخیص پروتئین در ادرار استفاده نمی شود. این به دلیل رنگ زرد خود ادرار است.
واکنش گزانتوپروتئین به طور فزاینده ای برای تعیین کمیت اسیدهای آمینه مانند تریپتوفان و تیروزین در پروتئین های مختلف استفاده می شود.
