کروماتوگرافی یکی از روش های جداسازی مواد است. برای تجزیه و تحلیل کیفی و کمی بعدی خواص فیزیکی و شیمیایی ریزذرات استفاده می شود. یکی از انواع این فناوری کروماتوگرافی میل ترکیبی است. ایده تمایز ترکیبات پروتئینی با استفاده از خاصیت میل ترکیبی مولکولی چندین دهه است که در علم شناخته شده است. با این حال، آن را تنها در سال های اخیر، پس از معرفی مواد آبدوست بسیار متخلخل مورد استفاده به عنوان یک ماتریس، توسعه خود را دریافت کرده است. این روش امکان حل مشکلات تحلیلی (جداسازی مواد و شناسایی آنها) و مسائل آماده سازی (تصفیه، غلظت) را فراهم می کند.
جوهر
کروماتوگرافی میل ترکیبی (از کلمه لاتین affinis - "مجاور"، "مرتبط") بر اساس برهمکنش های میل ترکیبی است، که تشکیل پیوندهای بسیار خاص بین یک مولکول فاصله دهنده (لیگاند یا وابسته) و یک مولکول هدف است. این مکانیسم ها در طبیعت گسترده هستند (اتصال واسطه ها یا هورمون ها و گیرنده ها، آنتی بادی ها وآنتی ژن ها، هیبریداسیون پلی نوکلئوتیدها و انواع دیگر فرآیندها). در پزشکی، کروماتوگرافی میل ترکیبی برای اهداف عملی از سال 1951 استفاده شده است
مؤلفه ها به شرح زیر جدا می شوند:
- محلول کاری حاوی ماده ای که باید جداسازی شود از طریق جاذب عبور داده می شود؛
- لیگاند رسوب‌شده روی ماتریکس جاذب این ماده را حفظ می‌کند؛
- متمرکز است (انباشت);
- استخراج ماده جدا شده از جاذب با شستشو با حلال.
این روش به شما اجازه می دهد تا سلول های کامل را جدا کنید. تفاوت با کروماتوگرافی جذبی سنتی این است که یک اتصال زیستی اختصاصی قوی از جزء جدا شده به جاذب وجود دارد که با گزینش پذیری بالا مشخص می شود.
جاذب
مواد زیر به عنوان جاذب استفاده می شوند:
- ترکیبات ژل بر پایه آگارز، پلی ساکارید به دست آمده از آگار. متداول ترین آنها 3 نوع هستند: سفاروز 4B، CL (آگاروز متقاطع) و آفی ژل. ترکیب دوم یک ژل اصلاح شده از آگارز و پلی آکریل آمید است. بی‌اثری بیولوژیکی، مقاومت شیمیایی و حرارتی بالایی دارد.
- سیلیکا (سیلیکاژل).
- شیشه.
- پلیمرهای آلی.
برای از بین بردن موانع مکانیکی در طول تماس لیگاند، از مواد اضافی برای جدا کردن آن از حامل استفاده می شود (پپتیدها، دی آمین ها، پلی آمین ها، الیگوساکاریدها).
تجهیزات
تجهیزات کروماتوگرافی ترکیبی شامل واحدهای اصلی زیر است:
- مخازن ذخیره سازی برای فاز متحرک (شوینده)؛
- پمپ های فشار قوی برای عرضه متوسط (اغلب رفت و برگشتی)؛
- فیلتر برای تمیز کردن مواد شوینده از گرد و غبار؛
- دستگاه دوز؛
- ستون کروماتوگرافی برای جداسازی مخلوط؛
- آشکارساز برای تشخیص اجزای جدا شده از ستون؛
- ضبط کننده کروماتوگرام و واحد ریزپردازنده (رایانه).
برای کاهش مقدار هوای محلول، ابتدا هلیوم از فاز متحرک عبور داده می شود. برای تغییر غلظت مایع شوینده چندین پمپ با کنترل برنامه نویس تعبیه شده است. ستون های کروماتوگرافی از فولاد ضد زنگ (برای افزایش نیاز به مقاومت در برابر خوردگی)، شیشه (گزینه جهانی) یا اکریلیک ساخته شده اند. برای اهداف آماده سازی، قطر آنها می تواند از 2 تا 70 سانتی متر متغیر باشد. در کروماتوگرافی تحلیلی، از میکروستون های Ø10-150 میکرومتر استفاده می شود.
برای افزایش حساسیت آشکارسازها، معرف هایی به مخلوط وارد می شوند که به تشکیل موادی کمک می کند که اشعه های بیشتری را در ناحیه ماوراء بنفش یا مرئی طیف جذب کنند.
روش شناسی
دو نوع اصلی کروماتوگرافی میل ترکیبی مایع وجود دارد:
- ستون، که در آن ستون با یک فاز ثابت پر شده و مخلوطی از آن با جریان عبور می کند.شسته شدن. جدایی می تواند تحت فشار یا تحت گرانش رخ دهد.
- لایه نازک. ماده شوینده در امتداد لایه جاذب مسطح تحت تأثیر نیروهای مویرگی حرکت می کند. جاذب روی صفحه شیشه ای، میله سرامیکی یا کوارتز، فویل فلزی اعمال می شود.
مراحل اصلی کار عبارتند از:
- تهیه جاذب، تثبیت لیگاند بر روی حامل؛
- تغذیه مخلوط جداسازی به ستون کروماتوگرافی؛
- بارگذاری فاز متحرک، اتصال جزء توسط لیگاند؛
- جایگزینی فاز برای جداسازی ماده متصل شده.
مقصد
کروماتوگرافی میل ترکیبی برای جداسازی انواع مواد زیر استفاده می شود (نوع لیگاند مورد استفاده در براکت مشخص شده است):
- آنالوگ های مهارکننده ها، سوبستراها و کوفاکتورهای آنزیمی (آنزیم ها)؛
- مواد بیو ارگانیک با نشانه های بیگانگی ژنتیکی، ویروس ها و سلول ها (آنتی بادی)؛
- کربوهیدرات با وزن مولکولی بالا، پلیمرهای مونوساکارید، گلیکوپروتئین ها (لکتین)؛
- پروتئین های هسته ای، نوکلئوتیدیل ترانسفرازها (اسیدهای نوکلئیک)؛
- گیرنده ها، پروتئین های انتقال دهنده (ویتامین ها، هورمون ها)؛
- پروتئین در تعامل با غشای سلولی (سلول ها).
این فناوری همچنین برای به دست آوردن آنزیم های بی حرکت استفاده می شود و اتصال آنها به سلولز باعث تولید جاذب های ایمنی می شود.
کروماتوگرافی پروتئین های متصل شونده به DNA
جداسازی پروتئین های متصل شونده به DNA با استفاده ازهپارین این گلیکوزامینوگلیکان قادر به اتصال طیف وسیعی از مولکول ها است. کروماتوگرافی میل ترکیبی پروتئین های این گروه برای جداسازی موادی مانند:استفاده می شود.
- عوامل شروع و طویل شدن ترجمه (سنتز مولکول ها و پروتئین های اسید نوکلئیک)؛
- محدود کننده (آنزیم هایی که توالی های خاصی را در DNA دو رشته ای تشخیص می دهند)؛
- لیگازها و پلیمرازهای DNA (آنزیم هایی که اتصال دو مولکول را برای تشکیل پیوند شیمیایی جدید کاتالیز می کنند و در همانندسازی DNA نقش دارند)؛
- مهارکننده‌های پروتئاز سرین که نقش مهمی در فرآیندهای ایمنی و التهابی دارند؛
- فاکتورهای رشد: فیبروبلاست، شوان، اندوتلیال؛
- پروتئین های ماتریکس خارج سلولی؛
- گیرنده های هورمونی؛
- لیپوپروتئین.
کرامت
این روش یکی از خاص ترین روش ها برای جداسازی ترکیبات واکنش پذیر (آنزیم ها و دانه های بزرگتر - ویروس ها) است. با این حال، نه تنها برای جداسازی مواد فعال بیولوژیکی استفاده می شود.
تشخیص آنتی بادی ها در مقادیر کم، ارزیابی کمی اسید پلی آدنیلیک، تعیین سریع توده های مولکولی دهیدروژنازها، حذف برخی آلاینده ها، مطالعه سینتیک فعال سازی شکل غیر فعال تریپسین، ساختار مولکولی انسان اینترفرون ها - این تمام فهرست مطالعاتی نیست که در آنها از میل ترکیبی استفاده شده است. کروماتوگرافی. استفاده در کلینیک به دلیل مزایای آن است از جمله:
- قابلیت تمیز کردن موثرپروتئین ها، پلی ساکاریدها، اسیدهای نوکلئیک. آنها از نظر خواص فیزیکی و شیمیایی کمی متفاوت هستند و در طی هیدرولیز، دناتوره کردن و سایر انواع درمان مورد استفاده در روش های دیگر فعالیت خود را از دست می دهند.
- سرعت جداسازی مواد، ماهیت دینامیکی فرآیند.
- بدون نیاز به خالص سازی آنزیمی خاص و همگن سازی ایزوآنزیم برای تعیین ثابت های تفکیک.
- قابلیت جداسازی طیف وسیعی از مواد.
- مصرف کم لیگاندها.
- امکان جداسازی مواد در حجم زیاد.
- فرایند برگشت پذیر اتصال ماکرومولکول های بیولوژیکی.
این تکنیک را می توان با دیگران ترکیب کرد تا میدان اضافی (گرانشی، الکترومغناطیسی) را تحمیل کند. این به شما امکان می دهد قابلیت های فنی کروماتوگرافی را گسترش دهید.
مهندسی آنزیمی
به لطف این روش، توسعه فعال شاخه جدیدی از بیوتکنولوژی - مهندسی آنزیم آغاز شد.
کروماتوگرافی میل ترکیبی برای جداسازی آنزیم دارای مزایای زیر است:
- دستیابی به آنزیم ها در مقادیر زیاد در نتیجه زمان کمتر، در نتیجه کاهش قیمت آنها؛
- بی حرکت کردن آنزیم ها می تواند به طور قابل توجهی دامنه کاربرد آنها را در پزشکی و صنعت گسترش دهد؛
- ارتباط آنزیم ها با یک تکیه گاه جامد نامحلول امکان مطالعه تأثیر ریزمحیط و جهت واکنش ها را فراهم می کند که نقش مهمی در فرآیندهای طبیعی و فیزیولوژیکی دارند.
